> VýukaSkip Navigation Links > ELFO 

Elektroforéza - zkratka ELFO

Elektroforéza je metoda, která se užívá k dělení látek, které nesou náboj (bílkoviny nebo ionty). Dělení látek závisí na celé řadě faktorů (probíhá podle rozdílné pohyblivosti ve stejnosměrném elektrickém poli, pohyblivost závisí na velikosti elektrického náboje, na pH prostředí, na velikosti molekul, na tvaru částic, na vlastnostech nosiče, na iontové síle pufru). V alkalickém prostředí se dělené látky pohybují k anodě, v kyselém ke katodě.

Elektroforéza se dělí na volnou, která se provádí v prostředí volného elektrolytu. Bílkovinné frakce se dělí na pruhy, které tvoří ostré pohyblivé rozhraní. Pohyb frakcí lze sledovat refraktometricky.

Další druhy probíhají na různých pevných nosičích. Nejpoužívanější je agarový a agarózový gel, polyakrylamidový gel a membránové folie. Málo používaný je škrobový gel a chromatografický papír.

Vodivost prostředí zajišťují pufry. Jsou to roztoky o dané koncentraci solí, pH, iontové síle a vodivosti. Mají za úkol přenos elektrického proudu a udržování stálého pH během dělení.

Technika práce s pomůckami pro elektroforézu na gelech

  • Rámeček pro upevnění gelu
  • Umístění gelu do rámečku
  • Nanášení vzorku do hřebínku
  • Nanesení vzorků pomocí hřebínku na připravený gel

Po rozdělení a obarvení se vyhodnotí denzitometricky.

Kapilární elektroforéza

Zvláštním způsobem elektroforézy je tzv. kapilární elektroforéza, která vyžívá elektrokinetických principů elektroforézy a elektroosmózy k dělení látek uvnitř křemenné kapiláry. Přístroj pracuje na principu dělení látek podle velikosti náboje i podle relativní molekulové hmotnosti. Konce kapilár jsou ponořeny společně s elektrodami z inertního materiálu do vialek (speciální nádobky) se separačním pufrem. Mezi elektrody ve vialkách se aplikuje vysoké napětí. Malý objem vzorku se dávkuje do konce kapiláry tlakem plynného dusíku nebo napětím. Vlivem vloženého napětí se nadávkované látky ze vzorku pohybují v elektrickém poli v kapiláře směrem od anody ke katodě nebo naopak a separují se podle rychlosti pohybu. Pohyblivost látek je také ovlivněna elektroosmotickým tokem separačního pufru. Na konci kapiláry je okénko detektoru, ve kterém je snímán signál. Detektory pracují na principu UV či fluorescenční detekce. UV detektor pracuje na principu fotometrie a měří absorbanci při různých vlnových délkách. Záznam závislosti odezvy detektoru na čase se nazývá elektroforegram. Je podobný chromatogramu. Poloha píků určuje kvalitu a plocha nebo výška píků kvantitu analytu. Lze užít i detektory, které měří vodivost nebo laserový fluorescenční detektor.

Běžně se provádí ELFO bílkovin séra. Bílkoviny se takto rozdělí na albuminy a skupinu globulinů. Globuliny se ještě podrobněji rozdělí na frakce alfa, beta a gama. Stanovení hodnot jednotlivých skupin a jejich poměru má význam u některých zánětlivých onemocnění, pro posouzení nutričního stavu organizmu a u některých jaterních nemocí aj.

Funkce plazmatických bílkovin zahrnuje celou řadu oblastí:

  • udržování koloidně-osmotického tlaku
  • transport důležitých látek (např. hormony, vitaminy, lipidy, bilirubin, léky)
  • nutriční funkce
  • udržování acidobazické rovnováhy
  • hemokoagulace a fibrinolýza
  • obranné reakce organizmu – humorální imunita
  • specifická imunita (imunoglobuliny)
  • nespecifická imunita (složky komplementu, bílkoviny akutní fáze)

Referenční hodnoty:

Albumin 55,1-66,7 %
Alfa-1-globulin 3,1-5,6 %
Alfa-2-globulin 8,0-12,7 %
Beta-1-globulin 4,9-7,2 %
Beta-2-globulin 3,1- 6,1 %
Gama globulin 10,3-18,2 %

paraprotein – negativní nález je v normě

Každá frakce obsahuje i další druhy bílkovin:

Alfa-1-globulin orosomukoid, alfa-1- fetoprotein…
Alfa-2-globulin alfa-2-makroglobulin, ceruloplasmin, feritin…
Beta-1-globulin složky komplementu C3 a C4, hemopexin…
Beta-2-globulin CRP, fibrinogen…
Gama globulin imunoglobuliny IgA, IgG, IgM, IgE, IgD

NĚKTERÉ PORUCHY V KONCENTRACI FRAKCÍ BÍLKOVIN

BÍLKOVINA KONCENTRACE
(g/l)
FUNKCE SNÍŽENÉ HODNOTY ZVÝŠENÉ HODNOTY
albumin 35-53 transportní protein
proteinová rezerva
nefrotický syndrom
chronická hepatopatie
akutní zánět
malnutrice
dehydratace
GLOBULINY
alfa1 0,5-2 vazba lipofilních látek těžká hepatopatie akutní zánět (pankreatitida)
alfa2  0,2-3 inhibitor proteáz
transport malých proteinů
transport iontů
akutní pankreatitida nefrotický syndrom
akutní zánět
beta 0,5-4,5 součást komplementu
aktivace komplementu
transport a vychytávání Fe
nadbytek železa
mnohočetný myelom
chronická hepatopatie
nedostatek železa
nefrotický syndrom
gama  0,6-18 pozdní i časné protilátky vrozené i získané
poruchy syntézy
nefrotický syndrom
mnohočetný myelom
chronické záněty
chronická hepatopatie

Nejčastější důvod pro stanovení elektroforézy je mnohočetný myelom. Ve výsledku se ukáže další frakce – M-komponenta (paraprotein). Pro upřesnění se provede imunofixace. Je to kombinace elektroforetického dělení bílkovin na jednotlivé frakce a imunologické reakce s monovalentním antisérem.

Video ELFO - kapilární

Animace ELFO postup

Media