HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie)

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC – High Performance Liquid Chromatography) se řadí mezi nejčastěji používané separační metody. Vyniká vysokou účinností, dobrou opakovatelností a robustností. Tato metoda je vhodná pro dělení organických méně těkavých kapalných a tuhých látek, které jsou rozpustné ve vodě, v organických rozpouštědlech nebo zředěných kyselinách.

HPLC je založena na separaci analytů na základě jejich distribuce mezi stacionární a mobilní fázi, která je vždy kapalná. Stacionární fáze je zakotvená v chromatografické koloně. Během separace dochází k mnoha typům interakcí. Uplatňují se interakce analytů s mobilní fází, interakce mobilní fáze se stacionární fází a sorpce analytů na stacionární fázi.

Vysokoúčinný kapalinový chromatograf pracuje tak, že jsou vzorky dávkovány dávkovacím ventilem do mobilní fáze. Ta unáší jednotlivé složky vzorku na kolonu, kde dochází k opakovanému ustanovení rovnováhy mezi mobilní a stacionární fázi a k separaci analytů dle fyzikálně-chemických vlastností. Po průchodu separační kolonou jsou analyty v mobilní fázi detekovány v průtokové cele detektoru. Měřenou veličinou je fluorescence, absorbance, index lomu, elektrická vodivost. Výstupem z detektoru je grafický záznam závislosti odezvy detektoru na retenčním čase, tj. chromatogram, na němž se hodnotí plocha nebo výška píku. Kvantitativní analýza se provádí na principu odečtení výsledku z kalibrační křivky.

Jako náplň kolon (stacionární fáze) se používají polární nemodifikované adsorbenty (silikagel, méně často oxid hlinitý) nebo náplně s chemicky vázanými stacionárními fázemi na silikagelovém nosiči. Jako mobilní fáze se většinou užívá voda, organická rozpouštědla a jejich směsi.

Je-li stacionární fáze polárnější než mobilní fáze, mluvíme o systémech s normálními fázemi. V opačném případě jde o systém s obrácenými fázemi.

Použití:

  • stanovení organických kyselin
  • bílkovin
  • vitamínů
  • léčiv
  • různých metabolitů

Stanovení léčiv

Stanovují se skupiny léků:

  • Antibiotika – gentamycin, vankomycin apod.
  • Cytostatika – methotrexát, busulfan
  • Bronchodilatační léčiva – teofylin apod.
  • Antiepileptika – primadon, fenobarbital, karbamazepin apod.
  • Antiarytmika – amiodaron
  • Antimykotika – vorikonazol, posakonazol

Terapeutická dávka léku je účinná dávka. Toxická dávka je takové množství, které je schopné vyvolat příznaky otravy. Terapeutická šíře je rozdíl mezi dávkou terapeutickou a toxickou. Bezpečnější jsou léky s velkou terapeutickou šíří (atropin) než léky s malou terapeutickou šíří (dioxin). Tyto léky se často stanovují.

Příklad výsledků stanovení některých léčiv s použitím různých detektorů
píky: 1. thiabendazol, 2. o-fenylfenol, 3. difenylamin, 4. ethoxychin, 5. bifenyl

Video kapalinová chromatografie HPLC

Schéma princip HPLC HPLC princip metody

Media