Fotometrie je nejčastěji využívaná analytická metoda v laboratořích klinické biochemie, která se využívá pro rutinní vyšetření. Její velkou výhodou jsou poměrně jednoduché přístrojové vybavení, možnost automatizace, vysoká přesnost a specifičnost (zvláště při použití enzymatických nebo imunochemických metod).
V každé moderní laboratoři klinické biochemie provádějící rutinní vyšetření nalezneme výkonné automatické analyzátory. Hlavní analytickou jednotkou těchto analyzátorů je fotometr.
Teorie
Fotometrie je analytickou metodou, která využívá interakce elektromagnetického záření s hmotou. Při průchodu elektromagnetického záření hmotou (roztokem) dochází k několika jevům: odrazu, absorpci, lomu a rozptylu záření.
Pro fotometrickou analýzu se využívá záření o vlnových délkách 200-740 nm. Tento rozsah odpovídá záření viditelnému a části blízké ultrafialové oblasti. Často se měří absorbance NADH jako produktu analytických reakcí při 340 nm.
Fotometrická měření jsou založena na Lambert-Beerově zákoně.
A = elc
A absorbance
e molární absorpční koeficient (l/mol/cm)
l délka kyvety (cm)
c koncentrace barevné látky (mol/l)
Z Lambert-Beerova zákona vyplývá, že absorbance je přímo úměrná koncentraci stanovované látky.
Pro správné měření koncentrace je nutné zvolit vhodnou vlnovou délku pro měření. Obvykle se pro volení vlnové délky světla pro měření využívá absorpčního grafu, nejčastěji se volí vlnová délka s absorpčním maximem.
Zdroj světla:
Jako zdroj světla se nejčastěji využívá wolframová žárovka, pro měření v oblasti UV lze přístroje doplnit deuteriovou výbojkou.
Monochromátor:
Zařízení, které slouží k výběru vlnové délky pro měření - optická mřížka, optický hranol, interferenční filtr (mřížka nebo hranol u spektrofotometru, filtry u fotometru).
Detektor:
Zařízení sloužící k detekci procházejícího světla založené na fotoelektrickém jevu (fotonásobič, fotonka).
Animace fotometrie
Video fotometrie